Sveučilište u Zagrebu Medicinski fakultet

Tumori zametnih stanica testisa (TGCT) najčešći su tumori mlađe muške populacije u svijetu. Naša epidemiološka studija iz 2011., pokazala je najviši trend porasta stope incidencije u svijetu te visok mortalitet u hrvatskoj populaciji. „Model-based“ istraživanja trendova rizika i demografskih kretanja iz 2014. ističu hrvatsku populaciju kao jednu od tri najugroženije u Europi te predviđaju da će u RH do 2025. jednom od 100 muškaraca godišnje biti dijagnosticiran TGCT. Upravo je seminom najčešći tip TGCTa, s trendom daljnjeg porasta. Smatra se da i (mikro)okolišni i (epi)genetski čimbenici dovode do njegova razvoja. Danas se epimutacije metilacije DNA kao tumorski biomarkeri ističu zbog svoje visoke frekvencije te izrazite kemijske i biološke stabilnosti, što im daje prednost u razvoju neinvazivne dijagnostike. Upravo se istraživanja biomarkera iz tjelesnih tekućina danas snažno potiču budući se taj koncept smatra jednim od temelja personalizirane medicine. Hipoteza je predloženog prospektivnog istraživanja da se u krvnoj plazmi i ejakulatu mogu identificirati biomarkeri seminoma na razini metilacije slobodne DNA. Usporedno s anamnestičkom i kliničkom obradom, sveobuhvatno istraživanje metilacije DNA provesti će se na uzorcima bolesnika prije i poslije terapijskog zahvata te rezultati usporediti s uzorcima zdravih muškaraca. Usporedba rezultata metiliranosti slobodne DNA i DNA tumora, kao i varijacije broja kopija gena, razjasnit će udio tumorske DNA u tjelesnim tekućinama, otkloniti pozadinski šum slobodne DNA zdravog tkiva te pokazati utjecaj genomskih aberacija na informativnost analize metilacije slobodne DNA. Usporedba ovih rezultata s proteinskom ekspresijom ispitivanih gena u seminomima u uzorcima istih bolesnika, razjasnit će odnos metoda suvremene molekularne patologije i predloženih novih pristupa u okviru razvoja personalizirane medicine. Očekuje se znanstveni doprinos u području razvoja epigenetičkih biomarkera u tjelesnim tekućinama onkoloških bolesnika.

Novotvorine sjemenika javljaju se kod muškaraca u dobi od 15 do 45 godina. Iako predstavljaju manje od 1 % svih neoplazija, uzrokuju pobol muškaraca u najreproduktivnijoj dobi. U posljednjih 20 godina bilježi se porast učestalosti testikularnih neoplazija. Prema procjenama „model-based“ istraživanja, Republika Hrvatska se nalazi među tri zemlje u kojima će do 2025. godine svaki 100. muškarac oboljeti od ove bolesti.

Tumori zametnih stanica testisa (TZST) čine ukupno 95% svih novotvorina testisa. TZST potječe od tumora zametnih stanica testisa in situ (GCNIS). Pod utjecajem (mikro)okolišnih i (epi)genetičkih čimbenika, mala populacija prastanica ili gonocita zaustavlja se u procesu diferencijacije te zadržava nezreli profil molekularnih biljega. Uistinu, GCNIS ima obilježja zaustavljenih i transformiranih gonocita s visokom ekspresijom embrionalnih pluripotentnih gena i metilacijom genoma.

TZST možemo podijeliti na seminome i neseminome. U sklopu projekta istraživat će se seminom testisa, najčešći tip TZST-a.

Nastanak seminoma usko je povezan s epigenetičkim mutacijama i specifičnim promjenama metilacijskih biljega DNA. Metilacija DNA je kovalentno vezanje metilne skupine na citozin u dinukleotidnom kompleksu citozin-gvanin (CpG) čime dolazi do inhibicije ekspresije gena. Nemetilirani geni eksprimiraju se u fenotip ali postaju i podložniji mutacijama u usporedbi s metiliranim genima. Upravo zbog toga stanice raka, koje redovito hipometiliraju vlastiti genom, sklonije su genomskim mutacijama što potiče daljnje nestabilnosti genoma. Relativno visoka frekvencija aberantne metilacije DNA pronađena u tumorima, dobar je biljeg različitih malignih tumora te postoje nagovještaji da se isti fenomen može očekivati i kod tumorske slobodne odnosno nestanične DNA (cfDNA). CfDNA je slobodna DNA koja se nalazi u tjelesnim tekućinama odnosno prostorima izvan stanica. U malim količinama nalazi se u plazmi zdravih osoba, dok u bolesnika s malignim oboljenjima koncentracija cfDNA je povišena. CfDNA nosi specifične metilacijske biljege za neke organe kod benignih tumorskih bolesti i upalnih oboljenja.

Jedan je od ciljeva projekta utvrditi obrazac i stupanj metiliranost cfDNA na jedinstvenim lokusima odabranih gena. Panel od osam gena odabran je sukladno dokazima njihove specifične epigenetičke ili genetičke deregulacije u seminomu. U istraživanju će se analizirati podaci o metilaciji cfDNA u krvi i ejakulatu te metilaciju stanične DNA, tumorskog i okolnog zdravog tkiva. Na taj način pokušat će se identificirati DNA-metilacijske biljege koji iskazuju najveće razlike u metilaciji između raka i pozadinske „kontaminacije“ slobodne DNA iz zdravog tkiva.

Sljedeći je cilj analizirati cfDNA te ustanoviti prisutnost genetičkih varijacija gena opisanih u genomskoj DNA seminoma. Varijacije u broju kopija gena mogu interferirati s našim kvantitativnim podacima, ali također mogu dati novu informaciju na razini genskih varijacija u cfDNA pacijenata sa seminomom.

Navedene analize provest će se i na uzorcima kontrolne skupine zdravih dobrovoljaca. Sve navedene analize bit će provedene na preoperativnim i postoperativnim uzorcima pacijenta sa seminomom. Ovaj dizajn omogućuje da pacijenti sa seminomom sami sebi postaju svojevrsna kontrola. Ipak, navedene analize provest će se i na uzorcima biološke kontrolne skupine zdravih dobrovoljaca.

Slika: Prikaz eksperimentalnog dizajna istraživanja.

Ekspresija proteina ciljanih gena kod bolesnika sa seminomom bit će određena imunohistokemijom dok će obrazac i stupanj metilacije cfDNA biti određeni bisulfatnim pirosekvenciranjem, a varijacije kopija gena pomoću qPCR-a i ddPCR-a.

Svrha ovog projekta je identificirati epigenetički biomarker u tekućim biopsijama, krvi i ejakulatu pacijenata sa seminomom sjemenikau cilju brže i jednostavnije dijagnostike bolesti.

Slika: Hodogram istraživanja.

Voditelj projekta:

Prof. dr. sc. Davor Ježek, dr. med., Zavod za histologiju i embriologiju, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu i Klinički bolnički centar Zagreb, Kišpatićeva 12, Zagreb, Hrvatska

Suradnici:

Prof. dr. sc. Floriana Bulić – Jakuš, dr. med., Zavod za medicinsku biologiju, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Šalata 3, Zagreb, Hrvatska

Prof. dr. sc. Maja Vlahović, dipl-ing. biol., Zavod za medicinsku biologiju, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Šalata 3, Zagreb, Hrvatska

Prof. dr. sc. Jerka Dumić, mag. med. biochem., Zavod za biokemiju i molekularnu biologiju, Farmaceutsko-biokemijski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Ante Kovačića 1, Zagreb, Hrvatska

Prof. dr. sc. Boris Ružić, dr. med., Klinika za urologiju, KBC Sestre milosrdnice, Vinogradska cesta 29, Zagreb, Hrvatska

Prof. dr. sc. Željko Kaštelan, dr. med., Klinika za urologiju Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu i Klinički bolnički centar Zagreb, Kišpatićeva 12, Zagreb, Hrvatska

Izv. prof. dr. sc. Dinka Pavićić Baldani, dr. med., Zavod za ginekologiju i opstetriciju, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu i Klinika za ženske bolesti i porode, Klinički bolnički centar, Petrova 13, Zagreb, Hrvatska

Prim. doc. dr. sc. Igor Tomašković, dr. med., Klinika za urologiju, KBC Sestre milosrdnice, Vinogradska cesta 29, Zagreb, Hrvatska

Doc. dr. sc. Nino Sinčić, dr. med., Zavod za medicinsku biologiju, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Šalata 3, Zagreb, Hrvatska

Doc. dr. sc. Monika Ulamec, dr. med., Klinički zavod za patologiju i citologiju “Ljudevit Jurak”, KBC Sestre milosrdnice, Vinogradska cesta 29, Zagreb, Hrvatska

Doc. dr. sc. Ana Katušić Bojanac, dipl. ing. biol., Zavod za medicinsku biologiju, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Šalata 3, Zagreb, Hrvatska

Doc. dr. sc. Marijana Čorić, dr. med., Zavod za patologiju Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu i Klinički zavod za patologiju i citologiju, Klinički bolnički centar Zagreb, Kišpatićeva 12, Zagreb, Hrvatska

Doc. dr. sc. Davor Tomas, dr. med., Klinički zavod za patologiju i citologiju “Ljudevit Jurak”, KBC Sestre milosrdnice, Vinogradska cesta 29, Zagreb, Hrvatska

Doc. dr. sc. Milan Milošević, dr. med., Zavod za zdravstvenu ekologiju i medicinu rada, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Rockefellerova 4, Zagreb, Hrvatska

Prim. dr. sc. Marija Gamulin, dr. med., Klinika za onkologiju, Klinički bolnički centar Zagreb, Kišpatićeva 12, Zagreb, Hrvatska

Dr. sc. Lana Škrgatić, dr. med., Zavod za ginekologiju i opstetriciju, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu i Klinika za ženske bolesti i porode, Klinički bolnički centar Zagreb, Kišpatićeva 12, Zagreb, Hrvatska

Dr. sc. Tomislav Kuliš, dr. med., Zavod za urologiju, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu i Klinički bolnički centar Zagreb, Kišpatićeva 12, Zagreb, Hrvatska

Tvrtko Houdolin, dr. med.,  Klinika za urologiju, Klinički bolnički centar Zagreb, Kišpatićeva 12, Zagreb, Hrvatska

Miroslav Tomić, dr. med., Klinika za urologiju, KBC Sestre milosrdnice, Vinogradska cesta 29, Zagreb, Hrvatska

Mr. sc. Dejan Ljiljak, mag. biol., Klinika za ženske bolesti i porodništvo, KBC Sestre milosrdnice, Vinogradska cesta 29, Zagreb, Hrvatska

Nina Gelo, mag. biol., Klinika za ženske bolesti i porode, Klinički bolnički centar Zagreb, Kišpatićeva 12, Zagreb, Hrvatska

Jure Krasić, mag. biol. exp., Zavod za medicinsku biologiju, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Šalata 3, Zagreb, Hrvatska

Dora Raos, mag. biol. exp., Zavod za medicinsku biologiju, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Šalata 3, Zagreb, Hrvatska

Ukupni budžet projekta 978.000,00 kn

INFORMACIJE ZA PACIJENTE

Rak testisa

Testis je parni organ smješten u skrotalnoj vreći (mošnjama) i dio je muškog spolnog i reproduktivnog sustava. Smješteni su ispod penisa, a glavna zadaća im je proizvodnja spermija i muških spolnih hormona kao što je testosteron.

Kada se stanice koje normalno čine tkivo testisa počnu nekontrolirano i ubrzano dijeliti zbog genetskih promjena koje se u njima zbivaju, nastaje rak testisa. Najčešće se javlja kod muškaraca u dobi 15 – 45 godina. U Republici Hrvatskoj, od raka testisa godišnje oboli oko 160 muškaraca. Većinu tih pacijenata se pravovremeno otkrije i moguće ih je učinkovito izliječiti. Pod većim rizikom obolijevanja su muškarci koji su nakon rođenja imali nespušten testis (kriptorhizam) i rak testisa kod krvnih srodnika.

Dvije su najčešće vrste raka testisa; seminomski koji čini približno ⅓ i neseminomski koji čini ⅔ svih rakova testisa.

Prvi simptom raka testisa je najčešće kvržica ili nateknuće na testisu koje u pravilu ne boli i koje pacijenti sami napipaju. Rijetko se javljaju neodređena tupa bol u području testisa ili donjeg dijela trbuha. Upravo zbog toga je vrlo važan redovan samopregled.

U slučaju sumnje na rak testisa, pacijent se upućuje na pregled ultrazvukom koji daje više informacija o veličini i karakteristikama promjene te može razlikovati tvorbe koje se nalaze u testisu ili izvan njega. Ultrazvuk je izvrsna slikovna metoda kojom se potvrđuje ili isključuje dijagnoza raka testisa u većini slučajeva. Dodatno se koriste tumorski markeri alfa fetoprotein (AFP), beta humani korionski gonadotropin (β-hCG) i laktat dehidrogenaza (LDH). Vrijednosti tih markera u krvi je nekad povišena kod raka testisa, a najveću vrijednost imaju u dugoročnom praćenju bolesnika jer njihov ponovni porast nakon operacije nagovještava povrat bolesti, odnosno da se bolest proširila izvan samog testisa.

Većina muškaraca sa sumnjom na rak testisa će biti upućena na snimanje kompjuteriziranom tomografijom (CT). To je metoda kojom se nastoji utvrditi je li se rak proširio izvan testisa, najčešće u retroperitonealne limfne čvorove ili organe kao što su pluća, jetra, kosti ili mozak.

Seminomski rak testisa ima dobru prognozu čak i ako se proširio u pluća. Neseminomski ima nešto lošiju prognozu, ovisno o širenju u druge organe i razini AFP u krvi.

Kirurško odstranjenje testisa je prva terapija izbora izbora za obje vrste raka. Operacija se dobro podnosi i nema utjecaj na plodnost muškaraca. Nakon odstranjivanja, testis se pregledava pod mikroskopom kako bi se definitivno potvrdila dijagnoza i vrsta raka.

U slučaju prisutnosti sekundariteta (metastaza) nakon kirurškog odstranjivanja testisa, postoje još dvije mogućnosti liječenja: kemoterapija i radioterapija. Obje metode su učinkovite kod seminomskih karcinoma, a kod neseminomskih karcinoma kemoterapija je metoda izbora. Prije kemoterapije preporuka je učiniti krioprezervaciju sjemena kako bi se kasnije, u slučaju potrebe, sjeme moglo koristiti u metodama umjetne oplodnje.

Neseminomski rak testisa ima nešto lošiju prognozu. Slabije reagiraju na radioterapiju i imaju veću mogućnost širenja na druge organe zbog čega je češće potrebno provoditi nekoliko ciklusa kemoterapije nakon kirurškog odstranjenja testisa.

Prvih nekoliko godina nakon operacije su nužne češće kontrole. Kombinacijom RTG i CT/MR snimki sa tumorskim markerima se na vrijeme može uočiti eventualni povrat bolesti. U većini slučajeva je prvi znak povrata bolesti upravo povišena razina tumorskih markera u krvi.

Rak testisa, iako rijedak, predstavlja značajan zdravstveni problem jer pogađa prvenstveno mlade ljude i najčešća je vrsta raka među osobama od 15 do 35 godina starosti. Najvažnija je metoda probira i ranog otkrivanja redovnim samopregledima testisa koji bi svaki muškarac trebao činiti. Važno je zapamtiti da pravodobno otkriveni rak testisa ima izvrsnu prognozu i visoku stopu izlječenja.

Dodatne informacije:

https://www.pocesisrazlogom.com/

Informacije na engleskom (info in english):

https://patients.uroweb.org/testicular-cancer/

Projekt razvoja karijera mladih istraživača – izobrazba novih doktora znanosti

Voditelj projekta i mentor: prof. dr. sc. Davor Ježek, dr. med.

Zavod za histologiju i embriologiju Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu

Trajanje: 4 godine (pretpostavljeno trajanje 01.10.2018.- 30.09. 2022.g.)

Financiranje: 72.660,00  (HRZZ i MEF-UNIZG)

Tumori zametnih stanica testisa (TZST) najčešći su tumori mlađe muške populacije u svijetu. Hrvatska je prema „Model-based“ istraživanjima trendova rizika i demografskih kretanja iz 2014. među tri najugroženije zemlje u Europi s tendencijom rasta rizika. Postoje dva tipa TZTS-a, seminom i neseminom. Seminomi kao i svi TZST, potječu od tumora zametnih stanica testisa in situ (GCNIS), koji imaju obilježja zaustavljenih i neoplastično transformiranih gonocita s visokom ekspresijom embrionalnih pluripotentnih gena i aberantnom metilacijom genoma. Do toga dolazi pod utjecajem (mikro)okolišnih i (epi)genetičkih čimbenika. U fokusu ovog Istraživačkog projekta (epiSem) su epigenetički poremećaji (epimutacije), posebice specifične promjene metilacijskih biljega DNA. One se smatraju  usko povezanim s nastankom seminoma te zbog toga smatramo da bi bile prikladni epigenetički biljezi, koji bi omogućili ranu dijagnozu seminoma.

Projekt razvoja karijere doktoranda vezan je uz gore opisani Istraživački projekt. U sklopu projekta, predviđa se upoznavanje doktoranda s temom i problematikom projekta epiSem. Doktorand će učiti i usvojiti osnovna znanja i vještine koje su potrebne za rad konkretno na projektu epiSem kao i u znanstvenim istraživanjima uopće. Doktorand će biti uključen u edukaciju o znanstvenom radu s pacijentima na kliničkom odjelu za patologiju te će u znanstvenoistraživačkom laboratoriju za epigenetiku i molekularnu medicinu naučiti suvremene laboratorijske tehnike poput pirosekvenciranja. Tijekom trajanja projekta, doktorand će imati mogućnosti prisustvovati na konferencijama, školama, edukacijama i sl., čime će steći iskustvo pripreme i prikaza svojih rezultata u različitim pisanim i usmenim formama. Nakon prikupljanja i obrade podataka, pristupnik će sudjelovati u izradi samog rukopisa, znanstvenih publikacija i vlastite doktorske disertacije, kao i u izradi mrežnih stranica koje će pomoći boljoj vidljivosti samog projekta. Sve navedeno doktorand će raditi pod nadzorom i vodstvom mentora i drugih suradnika na projektu. Kroz uspješno izvršene zadatke, doktorand će postati sposoban za samostalan rad u laboratoriju i znanstveno-istraživačkom okruženju.

Uz navedeno važno je istaknuti da će doktorand biti i dio skupine EpiMark. Grupa je sastavljena od mladih istraživača iz područja i bazičnih i kliničkih znanosti, koji su sposobni odgovoriti na izazove postavljene ostalim ciljevima ovog istraživanja, epiSem. Jedan od postavljenih ciljeva je nabava nove opreme, u svrhu poboljšanja infrastrukture, dane grupi na raspolaganje od druge grupe.

Ovaj projekt vezan je za Istraživački projekt „Epigenetički biomarkeri u krvi i ejakulatu bolesnika sa seminomom testisa“ (epiSem) Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu, voditelja prof. dr. sc. Davor Ježek, dr. med. Doktorand na projektu član je Znanstvene grupe za istraživanje epigenetičkih biomarkera (epiMark) Zavoda za medicinsku biologiju Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu.